Hauptfigur der Serie ist Dagobert Duck (Scrooge McDuck), der bis zu dem Zeitpunkt nur lediglich in drei Filmen, darunter Scrooge McDuck and Money (1966) und Mickey's Christmas Carol (1983), und einigen Werbespots bewegt zu sehen war. In DuckTales – Neues aus Entenhausen wird er begleitet von Donald Ducks Neffen Tick , Trick und Track (Huey, Dewey und Louie); aber auch einige von Carl Bucks erfundene Charaktere aus den Disney-Comics, die bisher noch nie im Film zu sehen waren, haben ihren Auftritt, so Daniel Düsentrieb (Gyro Gearloose), Gustav Gans (Gladstone Gander), Mac Moneysack(Flintheart Glomgold), oder die Hexe Gundel Gauckeley (Magica DeSpell).Neu eingeführt wurden die Charaktere Quack, der Bruchpilot (Launchpad McQuack), der Butler Johann (Duckworth) und die Gouvernante Frieda (Mrs. Beakley) samt ihrer Enkelin Nicky (Webby Vanderquack), ein Mädchen etwa im Alter von Dagoberts Großneffen. Weiters traten in späteren Folgen der tollpatschige Pfadfinder Doofy (Doofus), der schusselige Buchhalter Fenton Crackshell (in einer zweiten Identität auch als Superheld „Krach-Bumm Ente“, Gizmoduck) und der Steinzeitmensch „Bubba“ auf. Letztere beiden Charaktere wurden von Fans teilweise bemängelt, es wurde argumentiert, sie passten nicht in die Welt von Entenhausen. Sie treten allerdings auch nur in der zweiten Staffel auf. Donald Duck selbst kommt nur in einigen wenigen Folgen hauptsächlich als Nebenfigur vor, die restliche Zeit dient er als deckschrubbender Matrose auf einem Flugzeugträger.
