Wohnort der Little Ponies ist Ponyville, ein kleines Städtchen im Königreich Equestria. Die Ponies dieses Landes regeln die Natur, so hat jedes einzelne von ihnen einer besonderen Aufgabe nachzugehen. Die Erd-Ponies pflegen die Belange von Tier- und Pflanzenwelt, die Pegasus-Ponies kontrollieren aufgrund ihrer Fähigkeit zu fliegen die Abläufe in der Luft und die Einhorn-Ponies können mithilfe ihrer Hörner Magie anwenden, die sie in ihren Spezialfachgebieten einsetzen. Einige wenige sind Einhorn-Pegasus-Ponies (Alicorns), die alle Vorzüge in sich vereinen und mit ihrer Magie auch Himmelskörper bewegen können. Das besondere Talent eines Ponys spiegelt sich im Symbol des Schönheitsflecks („cutie mark“) wider, welches oberhalb des Hüftgelenks erscheint, sobald das Pony seine individuelle Gabe in sich entdeckt hat.
Die Geschichte beginnt mit dem Erscheinen des Ponys Twilight Sparkle in Ponyville, denn ihre Lehrerin Prinzessin Celestia hat sie beauftragt, dort die Geheimnisse der Freundschaft zu ergründen. Begleitet wird sie von dem Babydrachen Spike, der den Briefverkehr zwischen Lehrerin und Schülerin regelt. Sie lernt die Little Ponies Applejack, Pinkie Pie, Rainbow Dash, Fluttershy und Rarity kennen und erlebt mit ihnen viele Abenteuer.
